microRNA与人乳头瘤病毒16型的作用靶点研究

【摘要】前言人乳头瘤病毒(HumanPapillomaVirus,HPV),为一组微小无包膜的环状双链DNA病毒。现有的基础研究和流行病学调查证据表明,HPV感染尤其是高危型HPV感染几乎是所有宫颈癌发生的必要条件。宫颈癌是妇女常见的生殖道恶性肿瘤之一,全球每年约有49万新诊断宫颈癌病例,死于宫颈癌的患者超过27万。目前发现的HPV基因型别已经超过了200种,根据致瘤能力的高低,可以分为高危型、潜在高危型和低危型3类。经过长期大规模的研究积累及大量临床流行病学调查,超过99%的宫颈癌样本中包含HPVDNA,其中HPV16型在乳头瘤病毒中致病性最强且与肿瘤发病关系最密切,为最主要的感染型别,与宫颈鳞癌的发生密切相关。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约19～25个核苷酸的内源性非编码小RNA,是真核生物基因调控的重要组成成分,广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。通过转录后水平调节基因的表达而参与调控一系列的生命活动,包括细胞的发育、增殖及凋亡,脂肪代谢,激素分泌。近年的研究证据显示miRNAs参与了恶性肿瘤的发生,在多种肿瘤组织中发现miRNA表达异常,肿瘤细胞与正常组织细胞miRNA表达谱具有明显差异。对基因组中肿瘤相关基因区域序列分析时发现,有52.5%的miRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点附近,提示了miRNA在人类肿瘤形成机制中起重要作用。有学者认为在肿瘤组织中异常表达的miRNA可能存在类似癌基因或抑癌基因的作用。这些miRNA通过正向或负向调控肿瘤抑制基因、癌基因或控制细胞周期进程、分化或凋亡的基因,在肿瘤血管生成、肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡、浸润及转移等多种生理和病理过程中发挥重要作用。近年的大规模研究中发现,miRNA在其表达谱异常的乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中起重要作用。目前研究亦发现宫颈癌中存在miRNA表达谱异常,值得注意的是存在miRNA表达异常的多为高危型HPV阳性宫颈癌组织或细胞株。而在HPV阳性宫颈癌细胞株中对表达量异常的miRNA进行上调或下调,会影响细胞株的增殖、凋亡以及癌蛋白的表达。进行序列分析后发现于HPV整合位点附近出现miRNA基因的概率远高于非整合位点区域,以HPV16更为常见。随着对miRNA研究的深入,miRNA在病毒感染过程中的作用正逐渐被人们认识,其表达异常与病毒感染的密切关系引起了人们的注意,miRNA在病毒感染性恶性疾病中的机制研究也不断开展。其中,在HCV和HIV等慢性病毒感染中,miRNA与病毒编码区或非编码区互相结合引起病毒增殖及有助于受感染细胞长期持续表达的重要作用己得到证实；而在HBV阳性乙肝中高表达的miRNA也被证实可调节乙肝病毒自身的基因表达,参与病毒的致病,影响肝硬化和肝癌的发生；另外,一些致病性DNA病毒如疱疹病毒、多瘤病毒、腺病毒等在被感染细胞中可自身编码miRNA参与相关疾病的发生。由此我们猜测,是否存在与高危型HPV16直接作用的miRNA,通过与HPV16上相应靶点的结合,调控宫颈癌细胞的增殖、凋亡,从而影响宫颈癌的发生。但目前尚无相关研究发现miRNA与HPV存在直接靶向作用。在前期实验中,我们运用近年来研究miRNA较常用的生物信息学技术进行预测,从数据库中获得HPV16型标准全基因组序列以及已知的人类内源性miRNA序列数据,运用MiRanda、TargetScan、RNAhybrid等软件进行靶点作用预测,重点关注在预测过程中发现的最有价值的潜在作用靶点区域即HPV16的可变剪切(Alternativesplicing)位点区域。预测结果发现,hsa-miR-576-5p、hsa-miR-875-5p、hsa-miR-3144-3p、hsa-miR-199a四条miRNA可与HPV16的E6可变剪切区结合。本课题主要通过生物学实验对生物信息学预测结果进行筛选和验证,利用荧光素酶报告基因分析系统检验上述四条miRNA与其相应预测靶点是否结合。将验证结果阳性的miRNA转染进HPV16阳性宫颈癌细胞系SiHa细胞,进行后续细胞学实验,观察其对SiHa细胞凋亡、增殖及癌基因表达的影响,研究与HPV16作用的]miRNA对HPV16阳性宫颈癌细胞的增殖凋亡及癌基因表达的作用,对其参与HPV病毒致病的可能机制进行初探。第一部分miRNA载体质粒及靶序列荧光素酶报告基因载体的构建目的构建miRNA载体质粒及靶序列荧光素酶报告基因载体。方法选取表达miRNA较稳定、较高效的pSilencer4.1-CMV质粒进行miRNA表达载体的构建；选取近年来探索miRNA及其靶点结合研究中较新的psi-CHECK-2荧光素酶双报告基因质粒进行miRNA靶点序列载体的构建。通过PCR扩增目的片段、重组DNA、转化感受态细胞、培养转化成功菌株,最后提取重组后的质粒DNA并进行测序鉴定。结果测序后的结果显示,hsa-miR-576-5p、hsa-miR-875-5p、hsa-miR-3144-3p、hsa-miR-199a均成功重组进pSilencer4.1-CMV质粒DNA,得PSILENCER4.1-miR3144-CMV、PSILENCER4.1-miR576-CMV、PSILENCER4.1-miR875-CMV及PSILENCER4.1-miR199a-CMV;其位于HPV16上的相应结合靶点均成功重组进psi-CHECK-2荧光素酶双报告基因质粒DNA,得PSICHECK-2-HPV16-1、PSICHECK-2-HPV16-2、PSICHECK-2-HPV16-3PSICHECK-2-HPV16、PSICHECK-2-HPV16-5及PSICHECK-2-HPV16-6。小结成功构建了miRNA载体质粒及靶序列荧光素酶报告基因载体。第二部分双荧光素酶报告基因系统检测miRNA与其预测靶点结合情况目的检验生物信息学预测所得四条miRNA与其相应预测靶点是否结合。方法将miRNA载体质粒即PSILENCER4.1-miRNA-CMV与靶序列荧光素酶报告基因质粒即PSICHECK-2-HPV16-X共转染进HPV阴性宫颈癌细胞株C-33A,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910检测进行双质粒共转染24hr后的细胞中内参报告基因(萤火虫报告基因)荧光素酶表达量F1及主报告基因(海肾报告基因)荧光素酶表达量F2,其F2/F1比值即所得荧光素酶活性。结果PSILENCER4.1-miR199a-CMV及PSILENCER4.1-miR576-CMV与其相应靶基因荧光素酶质粒PSICHECK-2-HPV16-5、PSICHECK-2-HPV16-6及PSICHECK-2-HPV16-2、PSICHECK-2-HPV16-3共转染C-33A细胞后,荧光素酶活性与对照组比较无明显统计学意义(P>0.05)；PSILENCER4.1-miR875-CMV与其相应靶基因荧光素酶质粒PSICHECK-2-HPV16-4、PSILENCER4.1-miR3144-CMV与其相应靶基因荧光素酶质粒PSICHECK-2-HPV16-1共转染C-33A细胞后,荧光素酶活性与对照组比较明显减弱,数据具有统计学意义(P<0.001)。小结在生物信息学预测出的四条miRNA中,miR-875与其靶点HPV16-4结合；miR-3144与其靶点HPV16-1结合。第三部分miR-875及miR-3144对SiHa细胞调亡、增殖及癌基因表达的影响目的研究上调miR-875与miR-3144是否会影响HPV16阳性细胞株SiHa细胞的凋亡、增殖及癌基因表达。方法于体外培养HPV16阳性宫颈癌细胞株SiHa细胞,将miR-875与miR-3144载体质粒即PSILENCER4.1-miR875-CMV与PSILENCER4.1-miR3144-CMV转染SiHa细胞,转染24hr后观察细胞形态改变,通过AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用Hoechst凋亡细胞染色法观察SiHa细胞凋亡情况,使用RochexCELLigenceRTCADP细胞分析仪检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线。提取转染后SiHa细胞总RNA,采用半定量RT-PCR检测E6mRNA表达。结果与对照组及阴性对照组相比,转染PSILENCER4.1-miR875-CMV的miR-875实验组及转染PSILENCER4.1-miR3144-CMV的miR-3144实验组在AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪凋亡细胞率检测中,细胞凋亡率均显著增高(P<0.05)；在Hoechst凋亡细胞染色法中,荧光阳性率均显著增高(P<0.001)。使用RochexCELLigenceRTCADP细胞分析仪检测细胞增殖后检测CellIndex,结果提示与对照组及阴性对照组相比,转染PSILENCER4.1-miR875-CMV的miR-875实验组及转染PSILENCER4.1-miR3144-CMV的miR-3144实验组CellIndex显著降低(P<0.05)；绘制细胞生长曲线明显可见miR-875实验组及miR-3144实验组细胞增殖显著抑制。半定量RT-PCR结果显示,与对照组及阴性对照组相比,miR-875实验组及miR-3144中E6mRNA表达显著降低(P<0.05)。小结上调miR-875与miR-3144能促进HPV16阳性细胞株SiHa细胞的凋亡,抑制其增殖,降低E6mRNA的表达。结论1.miR-875与其靶点HPV16-4相互结合；miR-3144与其靶点HPV16-1相互结合。2.上调miR-875与miR-3144能促进HPV16阳性细胞株SiHa细胞的凋亡,抑制其增殖,降低E6mRNA的表达。
【作者】林琳；
【导师】徐丛剑；
【作者基本信息】复旦大学，临床医学（专业学位），2013，博士
【关键词】miRNA；HPV16；SiHa细胞；细胞凋亡；细胞增殖；E6mRNA；

【参考文献】
[1]何月顺,刘光萍,丁秋林.XML与面向Web的数据挖掘技术的应用研究[J].江西农业大学学报,2004,06:968-971.
[2]杨曼丽.双酰基硫脲类衍生物的合成及植物生长调节活性的研究（Ⅱ）[D].华中师范大学,有机化学,2004,硕士.
[3]梁铁柱,秦臻,李德毅.FIBER:基于频繁项目表的频繁模式挖掘方法[J].军事运筹与系统工程,2002,02:2-5+46.
[4]姜晨.基于空间磁场波形特性的架空配电线路故障定位方法的研究[D].华北电力大学,电工理论与新技术,2012,硕士.
[5]罗富华.软硬度可控胶体粒子的制备及应用[D].苏州大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[6]赵杨.基于集成芯片的RFID阅读器设计与实现[D].西安电子科技大学,电磁场与微波技术,2012,硕士.
[7]谢龙勇.金催化杂原子取代炔烃水合及α-羰基金卡宾反应研究[D].湖南大学,有机化学,2014,博士.
[8]孟焕平.两台生活泵交替运行互为备用的控制电路探讨[J].中外建筑.2002(06)
[9]魏巍.激光主动成像识别技术研究[D].吉林大学,机械工程,2013,硕士.
[10]王彦春.用等值线表征地震波各个频率成分的衰减[J].石油地球物理勘探,1990,05:617-623+646.
[11]刘联杰.产D-乳酸菌株的选育及发酵过程优化[D].湖北工业大学,发酵工程,2014,硕士.
[12]张钰晨.黄生《杜诗说》的诗学思想[D].宁夏大学,中国古代文学,2014,硕士.
[13]李宁.对外汉语初级口语教材练习研究[D].内蒙古师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[14]张晓凤.安卓平台移动社交网站一站式管理的交互设计[D].湖南大学,设计艺术学,2012,硕士.
[15]宋蕊.资源型区域经济转型升级的路径及对策研究[D].西安建筑科技大学,行政管理,2013,硕士.
[16]谭德彬,邬润龙,陈藻.利用数据挖掘技术支持反洗钱系统[J].金融电子化,2003,09:56-57.
[17]陈文娟.金属/TiO_2薄膜复合光催化剂的可见光催化性能研究[D].苏州大学,材料物理与化学,2014,硕士.
[18]刘晓东.基于行为特征的Android恶意软件检测技术研究[D].宁波大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[19]张梅凤.挖掘有效关联规则算法的分析与设计[D].郑州大学,2001.
[20]齐喜梅.中学生道德同一性、班级环境和欺负行为的关系研究[D].河北师范大学,心理健康教育,2012,硕士.
[21]段志青.犬尿氨酸对体液免疫应答的影响及其机制的初步探讨[D].北京协和医学院,生物化学与分子生物学,2014,博士.
[22]矫捷.基于JAVA SWING的办公自动化系统设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[23]陈华.英汉句法结构对比研究[D].西安电子科技大学,外国语言学与应用语言学,2004,硕士.
[24]王祥传.多元思维指引下历史教学设计初探[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[25]杨成彪.永昌电厂成本控制方案研究[D].西安理工大学,2003.
[26]关新.时谐涡旋电流问题中线性方程组的预处理方法[D].华东师范大学,计算数学,2013,硕士.
[27]庄盈婷.木薯叶片和叶绿体应答盐胁迫的比较蛋白质组学研究[D].海南大学,农业生物技术,2014,硕士.
[28]姚舜.移动Schatz机构的理论与实验研究[D].北京交通大学,2015.
[29]韩梅.南宋江湖诗派中的宗室诗人研究[D].西南大学,中国古代文学,2013,硕士.
[30]臧冀.Web上基于虚拟现实的扫描探针显微镜仿真培训系统[D].沈阳工业大学,计算机应用,2003,硕士.
[31]李娟,S.Wieghold,C-APalma,J.V.Barth.面向光电器件的超分子自组装先进平台[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第25分会：有机光伏[C].中国化学会:,2014:1.
[32]徐兰.民办幼儿园园长园本课程领导权力研究[D].西南大学,学前教育学,2013,硕士.
[33]周封,金丽斯,刘健,张再利.基于多状态空间混合Markov链的风电功率概率预测[J].电力系统自动化,2012,06:29-33+84.
[34]谢原.大学生身体自我发展特点及其对自我概念自我价值感的影响[D].陕西师范大学,基础心理学,2004,硕士.
[35]余竹焕.斜轧磨球轧辊孔型的计算机辅助设计及优化[D].西安理工大学,材料加工工程,2004,硕士.
[36]王敏.南宋蒙古语借词考论[D].内蒙古师范大学,汉语言文字学,2012,硕士.
[37]郑小花.左归丸联合橄榄油对妇科恶性肿瘤术后骨质疏松症的疗效观察[D].福建中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2014,硕士.
[38]昝自亮.顺铂在体外环境下对食管癌细胞增殖和凋亡影响的研究[D].大理学院,外科学,2013,硕士.
[39]郝丽丽,薛禹胜,Q.H.WU,徐泰山.电力系统受扰轨迹的差异度及其在参数识别中的应用[J].电力系统自动化,2010,11:1-7+47.
[40]黄胜男.技术交易供需系统设计与实现[D].北京工业大学,软件工程（专业学位）,2014,硕士.
[41]郑琦.某建筑火灾后的检测及加固分析[D].大连理工大学,建筑与土木工程（专业学位）,2012,硕士.
[42]姜茜.城市高中生职业理想调查研究[D].东北师范大学,心理健康教育,2012,硕士.
[43]王瑞龙.手术配合中药治疗退变性腰椎管狭窄症的临床观察[D].甘肃中医学院,中医骨伤科学,2014,硕士.
[44]冯文丰.动态MRI对颈椎椎间隙、椎管及脊髓的临床应用研究[D].河北医科大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[45]张伟娜.双查尔酮Luxenchalcone的全合成及乌尔曼方法学的研究[D].兰州理工大学,应用化学,2013,硕士.
[46]吕新明.啮合式电动机的基础研究[D].北京邮电大学,2011.
[47]马克.W钢铁公司转型升级途径研究[D].宁波大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[48]钟诗胜,林琳,李福军,王知行,庞贺伟,闫少光.基于实例的卫星污染环境预示系统方案设计[J].计算机工程,2003,06:38-39+149.
[49]高鹏.人脂肪干细胞对急性肺损伤大鼠肺内皮型一氧化氮合酶的影响[D].大连医科大学,麻醉学,2012,硕士.
[50]王勇.信息技术与小学科学整合模式研究[D].东北师范大学,教育技术学,2012,硕士.